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轉(zhuǎn)基因復(fù)印數(shù)熒光定量PCR辦法
挑選一種合宜的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，是應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)正確認(rèn)量模型板起初液體濃度的基礎(chǔ)。近年來(lái)，國(guó)里外的科學(xué)家做了不一樣的試驗(yàn)。Song(2002)等覺(jué)得理想的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)當(dāng)是已插進(jìn)去外源基因的植物基因組DNA ，況且用Southern blot正確測(cè)得插進(jìn)去的外源基因復(fù)印數(shù)。不過(guò)在實(shí)際研討中，很不容易得到到這么一套標(biāo)準(zhǔn)品。因?yàn)檫@個(gè)，他提出代替方案，依據(jù)外源基因復(fù)印數(shù)和野生型植物 DNA 的體積，按一定液體濃度比值混合，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。例如，在玉茭的外源基因復(fù)印數(shù)研討中它們發(fā)覺(jué)，在參加熒光染布材料SYBR GREEN I的20 μL PCR反響整體體系中，應(yīng)以6 ng野生型玉茭基因組DNA 作為模型板量。已知玉茭基因組DNA 體積為2.5 × 10.9 bp(Armuganathan和Earle 1999)，相應(yīng)于6 ng的玉茭DNA ，即可計(jì)算出摹擬1、2、4、8、16個(gè)外源基因復(fù)印時(shí)，應(yīng)參加的質(zhì)粒 DNA 的量。
利用新式、銳敏、高通量的實(shí)時(shí)熒光定量PCR辦法可以用于標(biāo)定原始品系中轉(zhuǎn)基因的*復(fù)印數(shù)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是一種較新的DNA 定量辦法。其定量的基本原理是在PCR反響整體體系中參加非特別優(yōu)異性的熒光染布材料(如：SYBR GREEN I)或特別優(yōu)異性的熒光探針(如：Taqman 探針)，實(shí)時(shí)檢驗(yàn)測(cè)定熒光量的變動(dòng)，取得不一樣樣品達(dá)到一定的熒光信號(hào)(閾值)時(shí)所需的循環(huán)回?cái)?shù)：CT值(Cycle Threshold)；經(jīng)過(guò)將已知液體濃度標(biāo)準(zhǔn)品的CT值與其液體濃度的對(duì)數(shù)畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，就可以正確認(rèn)量樣品的液體濃度。熒光定量 PCR 技術(shù)具備簡(jiǎn)單方便、敏捷的長(zhǎng)處，能夠管用擴(kuò)增低復(fù)印的靶斷片DNA ，對(duì)每克樣品中20 pg-10 ng的轉(zhuǎn)基因成分施行管用檢驗(yàn)測(cè)定。同時(shí)，與Southern法相形，熒光定量PCR技術(shù)可對(duì)T-DNA 的不一樣序列施行擴(kuò)增，因?yàn)檫@個(gè)能成功實(shí)現(xiàn)對(duì)品系中的基因重組的檢驗(yàn)測(cè)定干燥箱KLYQ、生化培養(yǎng)箱。
以這些個(gè)梯度混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，就可畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢驗(yàn)測(cè)定樣品的液體濃度并計(jì)算插進(jìn)去的復(fù)印數(shù)了。實(shí)驗(yàn)表明，用這種辦法取得的數(shù)值和 Southern blot 的zui后結(jié)果相當(dāng)*一樣。Giovanna(2002)將農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因西紅柿作為研討材料，挑選了雙元載體T-DNA 區(qū)上的兩個(gè)外源基因TSWV-N(Tomato spotted wilt virus)、nptⅡ(neomycin phosphoril-transferaseⅡ)和一個(gè)單復(fù)印的內(nèi)源基因(endogenous gene)作為熒光定量PCR擴(kuò)增的模型板，檢驗(yàn)測(cè)定外源基因復(fù)印數(shù)。他覺(jué)得運(yùn)用植物基因組 DNA 和一定比例質(zhì)粒的混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品，會(huì)累積很多沒(méi)有辦法防止的誤差。譬如運(yùn)用這種標(biāo)準(zhǔn)品不可少預(yù)先曉得待測(cè)植物基因組 DNA 的非常準(zhǔn)確分子量，并對(duì)植物 DNA 和質(zhì)粒正確認(rèn)量，但在大部分?jǐn)?shù)事情狀況下獲得的數(shù)值都只是近似商，再以資混合液作為標(biāo)準(zhǔn)品檢驗(yàn)測(cè)定每一植株的外源基因復(fù)印數(shù)時(shí)，便會(huì)放大這些個(gè)誤差。
因?yàn)檫@個(gè)，他提出“相對(duì)CT”或“δ-δCT”的辦法，這個(gè)辦法的長(zhǎng)處是不必為每每實(shí)驗(yàn)制造標(biāo)準(zhǔn)曲線，只消一個(gè)優(yōu)化步驟證實(shí)外源基因與內(nèi)源基因有相同的，至少是相仿的反響速率即可。與其他定量技術(shù)如 Southern Blot 相形，實(shí)時(shí)定量 PCR 技術(shù)的特別優(yōu)異性和高信嗓比特別的性質(zhì)為轉(zhuǎn)基因復(fù)印數(shù)定量供給了一點(diǎn)便捷。與實(shí)時(shí)定量 PCR 相形，DNA 點(diǎn)雜交技術(shù)要消耗的錢價(jià)不低的試藥、勞力以趁早間。每個(gè)條帶至少需求2微克的 DNA 用于放射性檢驗(yàn)測(cè)定或是至少 10 微克用于熒光檢驗(yàn)測(cè)定，因?yàn)檫@個(gè)，需求數(shù)量多的團(tuán)體樣品，實(shí)驗(yàn)務(wù)必等到每個(gè)植株通過(guò)傳代能夠供給足夠數(shù)目的團(tuán)體后才可以用于檢驗(yàn)測(cè)定復(fù)印數(shù)。電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、干燥箱KLYQ、培養(yǎng)箱KLYQ。
假如存在重組的話，zui后結(jié)果將更為復(fù)雜。定量PCR剖析的轉(zhuǎn)基因復(fù)印數(shù)稍高于Southern Blot的剖析zui后結(jié)果，主要端由是Southern Blot辦法在同一個(gè)插進(jìn)去位點(diǎn)有多復(fù)印的T-DNA 斷片插合乎時(shí)尚，轉(zhuǎn)基因植株的在酶切特殊情況萌生相仿的DNA 斷片，電泳剖析時(shí)很難分清。定量PCR辦法則防止了這種事情狀況的發(fā)生，錯(cuò)非目標(biāo)基因DNA 斷片在PCR引物處發(fā)生斷開(kāi)。兩種辦法剖析zui后結(jié)果的比較顯露定量PCR辦法剖析復(fù)印數(shù)更加管用、適合使用。
