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                                                      ELISA試劑盒操作步驟

方法一　用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法:

　　1.　包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1～10μg／ml。在每個(gè)聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml，4℃ 過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

　　2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃ 孵育1小時(shí)。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

　　3.　加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃ 孵育0.5～1小時(shí)，洗滌。

　　4.　加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時(shí)配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分鐘。

　　5.　終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值，若大于規(guī)定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

　　方法二　用于檢測未知抗體的間接法：

　　用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，

　　每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。

　　↓

　　加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔

　　中,置37℃孵育1小時(shí),洗滌。（同時(shí)做空白、陰性及陽性孔對照）

　　↓

　　于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體（抗抗體）0.1ml，

　　37℃孵育30-60分鐘，洗滌,zui后一遍用DDW洗滌。

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　　其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

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