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細菌多重 PCR 快速檢測
閱讀：818 發(fā)布時間：2023-9-12簡介
多重 PCR 是一種在普通 PCR 基礎(chǔ)上建立的一種可以同時擴增多個目的片段的檢測多種細菌分子生物學(xué)的技術(shù)，其利用多對特異性引物同時擴增，提高了擴增效率，節(jié)省了成本。優(yōu)點在于檢測的速度快、準(zhǔn)確性高和操作簡單，特別適用于臨床、環(huán)境和食品檢測等領(lǐng)域。
原理
多重 PCR 技術(shù)是在常規(guī) PCR 的基礎(chǔ)上加以改進后的一種新型技術(shù)，其基本原理與常規(guī) PCR 相同，是通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來達到目的片段的擴增。
當(dāng) DNA 雙鏈處于 90 ℃ 高溫時，雙鏈 DNA 會解旋成單鏈 DNA；當(dāng)溫度降到 60 ℃ 左右時，引物與特定的靶序列相結(jié)合; 當(dāng)溫度升到 72 ℃ 時即為 DNA 聚合酶的最適溫度，在依靠多種 dNTPs 底物的基礎(chǔ)上再通過堿基互補配對原則從而完成單鏈 DNA 的延伸工作，最終完成 DNA 雙鏈的配對合成。
多重 PCR 與常規(guī) PCR 的區(qū)別在于同一個反應(yīng)體系中所加入的引物對數(shù)不同。多重 PCR 可以特異性擴增出多條目的 DNA 片段。反應(yīng)體系的組成和 PCR 循環(huán)的條件需要經(jīng)過優(yōu)化以確保同時擴增多個 DNA 片段。理論上只要 PCR 擴增的條件合適，引物對的數(shù)量可以不限，但由于各種條件的限制，實際能夠擴增的引物對數(shù)量是有限的（～1 000 對）。
材料與儀器
目的菌株（以金黃色葡萄球菌為例），胰蛋白胨，細菌 DNA 提取試劑盒，LB 液體培養(yǎng)基，LB 固體培養(yǎng)基；PCR 熱循環(huán)儀，PCR 擴增儀等。
步驟
1、引物設(shè)計：選擇序列長度在 500 bp 以上的基因設(shè)計引物。先用 Primer 軟件，之后通過 Oligo 軟件和 BLASTN 算法進行分析，選擇二聚體少，自身不會形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，Tm 值在 60 ℃ 左右且與非 DNA 同源性較低的引物作為該基因的特異性引物，并送公司進行合成。最好進行引物評價實驗。
2、提取目的菌株 DNA：吸取樣品勻液，5 000 r/min 離心后棄去上清，參照細菌 DNA 提取試劑盒進行操作，提取樣品的基因組 DNA。
3、測定 DNA 濃度及純度： 當(dāng) 260 nm/280 nm 的比值在 1.8-2.0 之間表明提取的基因組 DNA 質(zhì)量較好。
4、多重 PCR 檢測：將所提取的基因組 DNA 作為模板，以設(shè)計的引物（SU4, smal，clfA）進行多重 PCR 反應(yīng)，25 μL 多重 PCR 反應(yīng)體系為：2.5 Μl 10 X PCR Buffer，1.0 μL MgCl2（4 mM），2.5 μL dNTP Mixture（各 2.5 mM），0.5 μL Taq 酶（5.0 U），2.0 μL DNA 模板，引物（10umol），添加 SU4, smal，clfA 分別為 2.6 μL、0.5 μL、1 μL，ddH2O 補足至 25 μL。
5、PCR 反應(yīng)程序為：① 94 ℃ 5 min；② 94 ℃ 30 s；③ 58 ℃ 30 s；④ 72 ℃ 45 s；⑤ 72 ℃ 10 min。②-④步重復(fù) 30 次。
6、配置 1.5% 瓊脂糖凝膠，使用電泳檢測多重 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。
7、在 EB 液中染色 10~15 分鐘后置于凝膠成像儀下查看電泳條帶結(jié)果。
注意事項
1. 當(dāng)比值大于 2.0 表明提取的基因組 DNA 中 RNA 含量較高，應(yīng)加入一定量的 RNase 酶去除溶液中的 RNA。
2. 目的片段長度不盡相同，而較小片段總是優(yōu)先擴增；
3. 各對引物最佳 PCR 條件不相同，較長的片段需要較長的延伸時間。為了保證最終擴增產(chǎn)量的一致性，在優(yōu)化反應(yīng)條件的時候，盡可能選擇有利于較大片段的擴增條件。
4. 多重 PCR 體系中，引物用量與擴增的目的片段長度有著正比內(nèi)在關(guān)系，即擴增片段越長，所需引物相對越多，另外引物間的相互影響會導(dǎo)致擴增效果不佳。
5. DNA 聚合酶的最適濃度為每 25 uL 反應(yīng)體積中添加 2 U，實際根據(jù)擴增效果進行輕微調(diào)整。
6. 高鹽濃度會使長片段的擴增產(chǎn)物難于變性解鏈。因而長片段產(chǎn)物在低鹽濃度下擴增效果較好，而短片段產(chǎn)物在高鹽濃度下擴增效果較好?？梢赃m當(dāng)提高 PCR 緩沖液濃度，或者提高 K+ 濃度至 70~100 mM。
7. 不同的細菌類型和樣品類型可能需要不同的提取和擴增方法，需要根據(jù)具體情況選擇合適的方法。同時在進行 PCR 擴增反應(yīng)時，需注意控制反應(yīng)條件和減少污染，以確保準(zhǔn)確性和可靠性。