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進口胎牛血清提取制備酶的經(jīng)典方法
閱讀：993 發(fā)布時間：2020-11-3進口胎牛血清提取制備酶的經(jīng)典方法，多采用硫酸銨分級沉淀，胰酶在 75% 飽和度硫酸銨中沉淀，其它雜蛋白一般在 10% 硫酸銨飽和度下被沉淀而除去。經(jīng)此多次提取，后在 PH8.0peng 酸緩沖液中得到結晶。
本實驗擬通過從豬胰臟中制備胰酶結晶實驗，掌握酶的制備、一般分離、提取、純化和結晶的操作技術。同時為親和層析、免疫學實驗準備實驗樣品。
1、胰蛋白酶原的提取與分離：稱取 1－1.5 Kg 新鮮豬胰臟，在冰浴下剝除脂肪和結締組織，在低溫下用絞肉機絞碎胰臟 (或用高速組織勻漿機搗碎) 加 1－2 倍體積以預冷卻的 PH2.5 - 3.0 乙酸酸化水溶液提取 (按 1 g 組織相當于 1 ml 體積計算，以此類推)。檢查提取液中 PH，若高于 PH3.0 時應及時用 10% 乙酸調節(jié)，使提取液維持 PH2.5－3.0 之間。在冷室 5℃ 左右攪拌提取 18－24 h，而后用 4 層紗布過濾，盡量擰擠出濾液，濾液呈乳白色，用約 300 mlpH2.5 乙酸酸化水再提取殘渣一次 (時間約為 1－2 h)，合并濾液，此時濾液 PH 值較高，可用 5M H2PO4 溶液調整 PH 至 2.5－3.0，放置 3－5 h 后，渾濁濾液冷卻后，用玻璃漏斗進行自然過濾，濾液呈黃色透明液體，收集濾液，量其總體積，棄去沉淀物。
2、鹽析：濾液加固體粉狀硫酸銨進行鹽析，使溶液至 75% 飽和度。鹽析溶液放冷室中過夜，次日用 4000r/min 離心機離心，或用布氏漏斗抽濾，濾餅經(jīng)壓干后稱重，可得約 20 g 胰蛋白酶原粗制品。
3、胰蛋白酶原得激活：將胰蛋白酶原粗制品用 10 倍體積得冷蒸餾水，分多次加入使濾餅溶解，溶液呈乳白色，量其體積，取出 1 ml 溶液用于測定，溶液中硫酸銨得含量 (約為濾餅重得 1 / 4)。因為硫酸銨可以與活化劑鈣離子結合，硫酸鈣，如果鈣離子過少會直接影響胰酶原的激活過程，按濃度量計算，將已研細的固體 CaCL2 慢慢加入酶原溶液中，邊加邊攪拌均勻。用 5MNaOH 溶液調 PH 至 8.0。在酶溶液加入約 5 mg 結晶豬胰蛋白酶，輕輕攪拌均勻，置 5℃ 冰箱中使酶原活化。
4、純化：去除雜蛋白，量取胰蛋白酶溶液體積后，用 5M 硫酸溶液調節(jié)濾液 PH 至 2.5－3.0，抽濾除去硫酸鈣沉淀，濾液體積約 1000 ml，加入已經(jīng)研細的硫酸銨粉末，使其溶液達 40% 飽和度 (每升濾液加 242 g 硫酸銨)。放置 5℃ 冰箱中 5－8 h, 抽濾除去沉淀。
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