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細(xì)胞培養(yǎng)中如何獲得單克隆

時間:2014-11-21閱讀:967
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        細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)常需要獲得單克隆,下面就給大家簡單介紹幾種方法:

方法一:單克隆細(xì)胞的培養(yǎng)就是這樣的,我現(xiàn)在作了15個96孔板的單克隆,總共才得到大約50株單克隆在做時候應(yīng)保證每個孔中的細(xì)胞是一個,因此,
在200毫升的培養(yǎng)液中加入小于96個的細(xì)胞,這樣平均到每個孔中因該可以由滿意的結(jié)果培養(yǎng)SPC-A1(人肺癌細(xì)胞),轉(zhuǎn)染了EGFP,然后進(jìn)行了G418抗性篩選和96孔板單克隆篩選,zui終獲得了成功。

方法二:實驗步驟大致為:預(yù)先對96孔板除*排之外的所有孔加含15%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液,0.1ml/孔,并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中溫育,
然后胰酶消化穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞,細(xì)胞液稀釋至密度為1000cell/ml的單細(xì)胞懸浮液,上述細(xì)胞液接種于96孔板的*排,0.2ml/孔,從中吸取0.1ml細(xì)胞溶液接種于第二排,混合后,從第二排中吸取0.1ml接種于第三排……,一直到第八排,zui后一排都丟棄0.1ml細(xì)胞液。一般來說,每一列都會有某個孔中只有1~2個細(xì)胞。

方法三:在顯微鏡下觀察,標(biāo)記孔中小于10個細(xì)胞的孔,然后在顯微鏡下用記號筆在皿底把單個熒光細(xì)胞圈住,然后在操凈臺里用滅過菌底牙簽將圈外的細(xì)胞戳死,
這樣留在孔中的就是單克隆了,通過這樣的,獲得了單克隆。但需注意的是:時間不能超過30min,否則細(xì)胞極容易死亡。
         解決操作時間長的方法:拿一個96板,在里面隨便種一些細(xì)胞,然后用牙簽練習(xí),我練了5~6次后非常熟練了。還有注意培養(yǎng)液:是含15%的胎牛血清,加大營養(yǎng),有利于細(xì)胞生長;另外一種方法是對還沒有變黃的細(xì)胞液進(jìn)行過濾,過濾后的培養(yǎng)含有很多生長因子,可以作為單克隆的培養(yǎng)液。

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