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尿酸酶活性檢測試劑盒說明書

微量法

注意：本產(chǎn)品試劑有所變動(dòng)，請注意并嚴(yán)格按照該說明書操作。

貨號：BC4435

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：使用前請認(rèn)真核對試劑體積與瓶內(nèi)體積是否一致，有疑問請及時(shí)聯(lián)系索萊寶工作人員。

溶液的配制： 

1、 標(biāo)準(zhǔn)品：臨用前加入898 µL蒸餾水得到1 mmol/mL的過氧*溶液，2-8℃保存4周。

2、 工作液A的配制：按照試劑二：試劑三：試劑四 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL，30S）的比例配制，用于樣本測定管、空白管及標(biāo)準(zhǔn)管的檢測。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時(shí)內(nèi)用完（2-8℃或者冰上保存）。

3、 工作液B的配制：按照試劑二：試劑三：試劑一 = 0.85mL：2.55mL：1.7mL（共5.1mL，30S）的比例配制，用于樣本對照管的檢測。根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時(shí)內(nèi)用完（2-8℃或者冰上保存）。

產(chǎn)品說明：

尿酸酶，又名尿酸*化酶，是一種參與嘌呤降解途徑的氧化酶，可以將尿酸分解為尿囊酸素進(jìn)而排出體外。尿酸為嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，積累過多將導(dǎo)致痛風(fēng)、腎病、心血管疾病等多種疾病的發(fā)生。尿酸酶在尿酸相關(guān)疾病的臨床檢測以及治療中有著重要意義。

尿酸酶催化尿酸分解為尿*素、CO₂和H₂O₂，H₂O₂氧化亞鐵*中的Fe²⁺生成Fe³⁺，Fe³⁺進(jìn)一步與4-氨基安*比林和酚反應(yīng)生成紅色醌類化合物，在505 nm處有特征吸收峰，通過測定505 nm處的吸光值來反映尿酸酶的活性。 

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、低溫離心機(jī)、水浴鍋/恒溫培養(yǎng)箱、微量玻璃比色皿/96孔板、研缽/勻漿器/細(xì)胞超聲破碎儀、冰、EP管、蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

組織：按照組織質(zhì)量（g）︰提取液體積（mL）為1︰5~10的比例（建議稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后10000 rpm，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

細(xì)菌或細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）: 提取液體積（mL）為500~1000 : 1的比例（建議500萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞加入1 mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率200 W，超聲3 s，間隔7 s，總時(shí)間5 min）；然后10000 rpm，4℃，離心10 min，取上清置于冰上待測。

二、測定步驟

1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長至505 nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、 將1 mmol/mL 標(biāo)準(zhǔn)液用蒸餾水稀釋為0.5 µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋：取20μL 1mmol/mL過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液，加入1980μL蒸餾水，充分混勻，配制成10μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液，再取50μL 10μmol/mL過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)液，加入950μL蒸餾水，充分混勻，配制成0.5μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液使用，現(xiàn)用現(xiàn)配。（實(shí)驗(yàn)中每管需要30μL，為減小實(shí)驗(yàn)誤差，故配制大體積）。

3、 操作表：(在1.5 mL離心管/96孔板中)

三、尿酸酶活性計(jì)算

（1）按樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活定義：在pH 8.8的條件下，每克樣本每小時(shí)分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個(gè)酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/g 質(zhì)量）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（W×V樣本÷V提取）÷T

= ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W

（2）按蛋白濃度計(jì)算

酶活定義：在pH 8.8的條件下，每毫克蛋白每小時(shí)分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個(gè)酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/mg prot）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（Cpr×V樣本）÷T

= ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷Cpr

（3）按照細(xì)菌數(shù)量或細(xì)胞計(jì)算

酶活定義：在pH8.8的條件下，每10⁴個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)分解尿酸產(chǎn)生 1 μmol 的H₂O₂定義為一個(gè)酶活力單位。

尿酸酶酶活（U/10⁴ cell）= ΔA測定÷（ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)準(zhǔn)）×V樣本÷（N×V樣本÷V提取）÷T

=ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷N

C標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，0.5 µmol/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.03 mL；V提取：提取液體積，1 mL；T：酶促反應(yīng)時(shí)間：0.5 h；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；N：細(xì)菌數(shù)量（以萬計(jì)）。

注意事項(xiàng)：

1、 A大于1.5時(shí)，建議將樣本用提取液稀釋后再進(jìn)行測定，并在計(jì)算時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。

2、 工作液A與工作液B，需根據(jù)樣本量現(xiàn)配現(xiàn)用，配后建議2小時(shí)內(nèi)用完。工作液本身淡黃的，隨著時(shí)間的延長，會(huì)變?yōu)榧t色，如有變色，則視為失效，需重新配制。

實(shí)驗(yàn)實(shí)例：

1、 取0.1g小鼠肝臟進(jìn)行樣本處理，取上清稀釋4倍后按測定步驟操作，使用96孔板測定計(jì)算ΔA測定=A測定管-A對照管=0.804-0.285=0.519，ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管=0.741-0.051=0.690，按樣本質(zhì)量計(jì)算酶活得：

尿酸酶酶活（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷W×4（稀釋倍數(shù)）= 0.519÷0.690÷0.1×4（稀釋倍數(shù)）=30.09 U/g 質(zhì)量。

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