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利用血清篩選噬菌體文庫
閱讀：577 發(fā)布時間：2011-8-10利用含有目標受體的復(fù)雜混合物，對噬菌體展示肽文庫進行篩選。這適用于許多令人感興趣的生物體系，如血清、腦脊液及其他生物性體液和細胞或組織表面等。在此情況下，目標就是要鑒定出結(jié)合于特定受體分子或結(jié)合于一組具有特定性質(zhì)的受體上的多肽。
我們及他人都在致力于鑒定那些可與疾病特異性相關(guān)的抗體（疾病特異性抗體，DS-Ab）相結(jié)合的多肽。這里我們所描述的方法，是用來鑒定丙型肝炎感染（HCV）特異性相關(guān)抗體的相應(yīng)配體。HCV是一種性慢性肝病的主要病因。利用來自HCV感染者和非感染者的血清（以下分別稱為陽性血清和陰性血清）進行噬菌體展示文庫篩選。該實驗方案涵蓋了從構(gòu)建噬菌體文庫到鑒定HCV特異性抗體配體的全部實驗步驟。本章所提及的大部分思路和實驗方案同樣適用于其他復(fù)雜的受體體系。
隨機肽文庫
目前主要有兩種利用絲狀噬菌體的噬菌體展示系統(tǒng)，均已被開發(fā)并廣泛應(yīng)用超過15年。外源肽段是以N端融合到次要（pⅢ）或主要衣殼蛋白（pⅧ）的形式進行表達的。區(qū)分這兩種表達系統(tǒng)的特征是其每個噬菌體顆粒所展示的拷貝數(shù)目：在基于pⅢ的系統(tǒng)中，每個噬菌體展示拷貝數(shù)可從少于1個至多達5個；而基于pⅧ的系統(tǒng)中，每個噬菌體衣殼上卻可以展示數(shù)十到數(shù)百個多肽。后一種特性業(yè)已證明在用血清篩選，尤其是對隨機肽文庫篩選時，具有更顯著的優(yōu)勢。實際上，噬菌體表面上多肽的高拷貝展示，增加了噬菌體-抗體相互作用的親和性，從而即使不是全部，也可以選擇到血清樣本中的大多數(shù)抗體。通過在體外將合成的隨機序列克隆到展示載體上來構(gòu)建文庫，而后連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到細菌中。以前這zui后一步的效率將噬菌體文庫復(fù)雜度限制在包含不超過108個不同序列以內(nèi)。因此，隨機肽文庫通常只包含了所有可能序列的很少部分。我們已試圖通過增加肽文庫的有效復(fù)雜度來改進這種狀況。用一種密碼子為基礎(chǔ)的方法合成隨機序列，即每一位點僅有20個用于編碼20個不同氨基酸的三聯(lián)體密碼子，如此就消除了密碼子的簡并性并剔除了終止密碼子。
天然表位文庫
在傳染性因子已知并可得到其基因組的情況下，一種鑒定DS-Ab配體的誘人方法是構(gòu)建一個噬菌體展示互補DNA（cDNA）文庫，然后用來自病人的血清篩選。這種方法有明顯優(yōu)勢，這是因為天然表位序列可優(yōu)先涵蓋于噬菌體文庫中。然而，必須記得，在整合到噬菌體顆粒之前，融合在pⅢ或者pⅧ上的配體要先移行通過大腸桿菌的分泌胞器并轉(zhuǎn)運到外周質(zhì)腔中折疊。妨礙融合肽的正確加工和（或）折疊過程，可能會極大地影響這些噬菌體文庫的有效復(fù)雜度。
在天然表位文庫中，特別對于那些構(gòu)象表位，外源肽的大小可能比噬菌體表面所能展示的拷貝數(shù)更加重要。這就是為什么pⅢ或pXⅢ均會被采用的原因。在此，我們描述一個噬菌體文庫的構(gòu)建，來自HCV基因組的序列將被展示在噬菌體表面上。