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美麗線蟲體的抗體染色
閱讀：674 發(fā)布時間：2011-3-24無論使用哪種固定方法，抗體結(jié)合及檢測的步驟基本相同。其方法學及理論與其他組織來源的染色均相似。在鑒定和證實陽性反應方面應注意交叉反應。在前述組織切片染色部分已討論關于抗體選擇和對抗原正確定位的方法。對于在蟲體中進行抗原免疫定位的一個主要優(yōu)點是可檢測一個無效基因。如果可能的話，它對某些動物染色是非常有用的，這些動物可以攜帶一個突變基因或用RNAi處理過的，以抑制所研究抗原的合成。這樣會提供一個有用的對照，從而證實一種染色模式。顯然，在某些情況下，如基因功能的缺失是致命的，這種對照將是不可能的。
對于蟲體免疫染色來說，zui常用的方法是應用熒光染料標記的試劑。在對蟲體的抗原進行研究中常常不使用酶標的二級試劑。其原因主要在于熒光染料對于抗原定位具有高度分辨力。
1．背景問題
影響蟲體染色的一個重要因素是由于特異性和非特異性的交叉反應所造成的較高背景。除了在檢測復雜組織的抗原時所遇到的問題外，蟲體染色尚有一些特殊的問題。
*個問題是通過強烈固定和透化處理方法可破壞許多抗原表位，增加了交叉反應發(fā)生的可能性。故需要使用多種抗體，并從中發(fā)現(xiàn)一種于所檢測抗原的抗體。
蟲體免疫染色所涉及的另一問題是多克隆抗體的使用。多克隆抗血清幾乎均含有抗細菌的抗體，這些細菌存在于產(chǎn)生抗體的宿主動物體內(nèi)。通常存在于腸道和皮膚，或在抗感染過程中形成。因為蟲體通常以細菌，如大腸埃希菌為食，這些抗體會混淆染色模式。如有可能，應使用單克隆抗體以代替多克隆抗體。如果使用多克隆抗體，可以采用兩種策略：①所需的抗體可以通過抗原親和柱純化；②不是所需的抗體可以通過使用丙酮干燥臟粉預吸收去除。
2．蟲體的復染
在應用免疫熒光技術檢測蟲體，復染是必要的。復染還可用以鑒定抗原在細胞中的確切位置?？刹捎脙煞N通常的方法：①使用一種對核酸特異的熒光染料標記所有的細胞，通常DAPI適用于落射式熒光顯微鏡，碘化丙酮（P1）適用于共聚焦顯微鏡。將這些染料加到洗滌緩沖液中即可；②利用受組織特異啟動子驅(qū)使的GFP。將這些基因插入到表達載體中，通過其表達來鑒定細胞。正常情況下使用GFP表達，或者使用GFP抗體（可購買）。
3．對照
特異性染色反應需要與對照進行比較。為了準確評價染色模式，應對來自同一種屬的兩種抗體進行比較。對于多克隆抗體，的對照是事先從制備特異性抗體的同一動物免疫前采集的血清，但也可以使用來自相同種屬的非免疫動物的血清。對于單克隆抗體而言，對照應該與特異性抗體的來源相同；例如，細胞培養(yǎng)上清對比上清，小鼠腹水對比腹水，純化抗體對比純化抗體。對照抗體應該與特異性抗體的類和亞類相同。來自親代骨髓瘤的細胞培養(yǎng)上清不適合作為對照，因為其中并不包含抗體。適宜的對照雜交瘤細胞株可從ATCC或歐洲動物細胞培養(yǎng)保藏中心獲得。此外，應該檢測二級試劑。在可能的情況下，同時對攜帶所研究抗原基因缺失的蟲體進行染色。這將為特異性抗體提供一個*的遺傳對照。