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上海聯(lián)碩生物科技有限公司
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免疫共沉淀 簡介

時間：2009/6/17閱讀：2605
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蛋白質(zhì)間相互作用研究方法：免疫共沉淀
1．用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養(yǎng)板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中。
2．將每毫升細胞懸液轉(zhuǎn)移到微量離心管中，在微量離心機上4℃以zui大速度離心15 min。
3．收集上清（約30 ml）并加入30μg的適當抗體，4℃搖動免疫沉淀物1 h。
4．加入0.9 ml的蛋白質(zhì)A-Sepharose 懸液，4℃搖動免疫沉淀物30 min。
5．用含900 mmol/L NaCl的NETN洗蛋白A-Sepharose混合物，再重復(fù)洗5次。zui后，用NETN洗一次。
6．吸出混合物的液體部分。加入800μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中，煮沸4 min。
7．將樣品加入到大孔的不連續(xù)SDS-PAGE梯度膠中，在10 mA的恒定電流下電泳過夜。
8．通過考馬斯藍染色觀察蛋白質(zhì)泳帶。
9．從膠上切下目標帶，將其放到微量離心管中，用1ml 50%乙腈洗兩次，每次3 min。
10． 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質(zhì)，再將肽電洗脫。
11． 通過窄孔液相色譜分離肽。將收集的肽在ABI 477A或494A機器上進行自動Edman降解測序

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