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樣本制備方法之蛋白提取的總原則及注意事項
點擊次數(shù)：5339 發(fā)布時間：2020-11-17
樣本制備是實驗的步驟，也是決定實驗成敗的關(guān)鍵步驟，獲得的蛋白質(zhì)樣品必須均質(zhì)、可溶，并解離成單個多肽亞基，且盡量減少相互間的聚集，使其僅依賴本身的分子量大小進行分離。常見的樣本來源有重組蛋白、細胞和組織等。
蛋白提取的總原則和注意事項：
1.盡可能提取*或降低樣本復(fù)雜度，只集中提取目的蛋白；
2.保持蛋白處于溶解狀態(tài)（通過裂解液的pH鹽濃度，表面活性劑，還原劑等的選擇）；
3.提取過程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修飾等（低溫操作，加入合適的蛋白酶和磷酸酶抑制劑）；
4.盡量除去核酸、多糖、脂類等干擾分子（通過加入核酸酶或采取不同提取策略）；
5.樣品分裝，長期于-80℃保存，避免反復(fù)凍融。
細胞裂解：
1.培養(yǎng)的細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗2次，裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑；
2.吸盡PBS，加入預(yù)冷的裂解液（1mlper107cells/100mmdish/150cm2flask）；
3.用細胞刮子刮取貼壁細胞，將細胞及裂解液溫和地轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的微量離心管中；
4.4℃搖動30mins；
5.4℃，12000rpm離心20mins；
6.輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀。
組織裂解：
1.用滅菌的預(yù)冷的工具分離目的組織，盡量置于冰上以防蛋白酶水解；
2.將組織放在圓底微量離心管或EP管中，加入液氮凍結(jié)組織于冰上勻質(zhì)研磨，長期可保存于-80℃；
3.每5mg加入約300ul預(yù)冷的裂解液，冰浴勻漿后置于4℃搖動2小時，裂解液體積與組織樣本量有適當(dāng)比例（蛋白濃度至少達0.1mg/ml，理想的蛋白濃度應(yīng)為1-5mg/ml）；
4.4℃，12000rpm離心20mins，輕輕吸取上清，轉(zhuǎn)移至新預(yù)冷的微量離心管中置于冰上，即為蛋白樣本，棄沉淀。