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提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的操作步驟
點(diǎn)擊次數(shù)：7393 發(fā)布時(shí)間：2020-5-8
在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白的操作步驟：
1.決定細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)應(yīng)該是80%或者更好；
2.用離心機(jī)以1500r/min離心5min；
3.棄上清液，用等體積的冷PBS洗細(xì)胞，像步驟2那樣，反復(fù)3次；
4.根據(jù)估計(jì)的沉淀量加入5倍體積的isotonic lysis buffer到細(xì)胞顆粒中，使細(xì)胞溫和懸浮，盡量避免泡沫；
5.加入裂解液lysis buffer在懸浮的細(xì)胞中，并放在冰上15min讓細(xì)胞膨脹，可以通過(guò)顯微鏡檢查；
6.對(duì)于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中膨脹的細(xì)胞，加入10%的IGEPAL CA-630使*后的濃度達(dá)到0.3%，混勻，加的時(shí)候要溫和；
7. 立即離心（量大的可以用1.5mlde EP管，以5500r/min離心30s；量大的可以用50ml的管子以5500r/min離心2min）；
8.轉(zhuǎn)移上清液（細(xì)胞質(zhì)蛋白）到一個(gè)新的冷凍管中；
9.用懸浮顆粒5倍體積的isotonic lysis buffer懸浮細(xì)胞，并混勻；
10.用離心機(jī)離心細(xì)胞懸浮液，以1500r/min離心5min，移掉上清液；
11.用2/3倍體積的extraction buffer懸浮顆粒；
12.把管子放置在震蕩混勻器上，以700r/min，15min震蕩混勻，接著以1400r/min,15min,整個(gè)過(guò)程要仔細(xì)，避免泡沫產(chǎn)生；
13.以9400r/min離心15min，離心完后轉(zhuǎn)移上清液到一個(gè)新的冷凍離心管中；
14.分成幾份用液氮冷凍，并且保存起來(lái)（長(zhǎng)期保存應(yīng)放在-80℃上，短期保存要放在-20℃上）。