類固醇激素，又稱甾體激素，調(diào)節(jié)人體多種機(jī)能，在臨床診斷發(fā)揮著重要的作用。在前面的推文中，我們已經(jīng)分享過一種關(guān)于臨床檢測(cè)中19種類固醇激素的反相SPE前處理及相應(yīng)的LC-MS/MS分析方案，這周我們?yōu)榇蠹曳窒砹硪环N前處理方案：固相支撐液液萃?。⊿olid-Supported Liquid Extraction, SLE）方法在其中的應(yīng)用。
SLE操作步驟如下：
| 步驟 | 操作 |
| 樣品預(yù)處理 | 200µL血清樣本與200µL pH為6的乙酸銨水溶液混合 |
| 上樣 | 在Novum PRO SLE, MAX 96孔板(Part No.: 8E-S539-5GA)中加入400µL預(yù)處理之后的樣品，適當(dāng)施壓待樣品浸入填料，5分鐘后進(jìn)行洗脫 |
| 洗脫1 | 900µL二氯甲烷或者乙酸乙酯（必要時(shí)適當(dāng)施壓） |
| 洗脫2 | 900µL二氯甲烷或者乙酸乙酯（必要時(shí)適當(dāng)施壓） |
| 氮吹濃縮 | 45℃ |
| 復(fù)溶 | 100µL 0.5mM的氟化銨水溶液/甲醇（60:40, V:V）復(fù)溶 |
PS: pre-spiked samples
PoS: post-spiked samples
圖6 Kinetex C18分離類固醇相關(guān)異構(gòu)體總離子流圖
圖7 部分化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線
表6 標(biāo)準(zhǔn)曲線，LLOQ和S/N結(jié)果匯總
圖8 部分化合物L(fēng)LOQ限度譜圖示例
表7 回收率及準(zhǔn)確度結(jié)果
表8 精密度，基質(zhì)效應(yīng)和方法回收率結(jié)果
Kinetex 2.6µm C18色譜柱在正離子和負(fù)離子模式下在8min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了對(duì)類固醇相關(guān)異構(gòu)體的良好分離（圖6）。使用二氯甲烷洗脫時(shí)，除17羥基孕烯醇酮和DHEAS外，其他組分線性良好，R2>0.99；當(dāng)使用乙酸乙酯洗脫時(shí)，所有組分R2>0.98（圖7、表6）。對(duì)于準(zhǔn)確度而言，使用二氯甲烷洗脫時(shí)，除17羥基孕烯醇酮和DHEAS外都在80%~112%之間，而使用乙酸乙酯洗脫時(shí)候，所有組分準(zhǔn)確度都在91%~118%之間（表7）。
此外，使用二氯甲烷洗脫時(shí)，回收率在13%~87%之間（表7），其中18羥基皮質(zhì)酮（13%）、醛固酮（21%）、孕酮（28%）、皮質(zhì)醇（24%）和可的松（52%）回收率均較低。在使用乙酸乙酯洗脫時(shí)，除DHEAS外，所有組分回收率均在84%~110%之間。本次研究中發(fā)現(xiàn)DHEAS在SLE方法下基本無回收，建議使用反相SPE方式進(jìn)行前處理。
本方案中所開發(fā)的SLE方法簡(jiǎn)便有效可重復(fù)性強(qiáng)，所用到Novum PRO SLE, MAX 96孔板可實(shí)現(xiàn)快速、高通量的樣品前處理。分析中用到的Kinetex 2.6µm C18色譜柱也可在8分鐘內(nèi)對(duì)相關(guān)類固醇化合物進(jìn)行有效分離，實(shí)現(xiàn)LC-MS/MS方法的準(zhǔn)確定量。
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